Estudio de eficacia y toxicidad de preparados de Plata Coloidal producidos por Santé Naturels® realizado en la UNIVERSIDAD DE NÁPOLES FEDERICO II - Escuela Politécnica y Ciencias Básicas - Departamento de Biología, con evaluación de los efectos sobre células procariotas y eucariotas mediante ensayos in vitro
Prólogo del Dr. Domenico Martini
La actividad antibacteriana de la plata coloidal Santé Naturels® se evaluó con pruebas de actividad antibacteriana en placas y en líquido sobre cepas bacterianas y fúngicas como: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. La cepa fúngica es Candida Albicans. Los resultados de estos ensayos demuestran que la plata coloidal ejerce un efecto antibacteriano/antifúngico relevante en comparación con un antibiótico tradicional utilizado como control positivo.
Se evaluó la posible toxicidad de la plata coloidal sobre diferentes tipos de células humanas en cultivo como HaCat (línea de queratinocitos humanos); HeLa (línea de adenocarcinoma cervical); Caco-2 (línea de adenocarcinoma de colon); HDF (Human Dermal Fibroblast) a través del ensayo MTT, una prueba de viabilidad celular. El tratamiento con plata coloidal de Santé Naturels® no provoca efectos tóxicos en las condiciones experimentales analizadas. Por el contrario, la plata iónica, utilizada como control positivo, ejerce un efecto tóxico significativo, lo que resulta en una disminución drástica de la viabilidad celular incluso a bajas concentraciones, por lo que la plata iónica tiene un alto grado de toxicidad.
Podemos concluir que este estudio realizado por la Universidad Federico II de Nápoles ha demostrado que la plata coloidal de Santé Naturels® tiene excelentes propiedades antibacterianas y antifúngicas y no es tóxica para varias células en cultivo en las condiciones analizadas.
La plata coloidal Santé Naturels® ha demostrado importantes propiedades curativas para el tejido epitelial.
ANÁLISIS DEL INFORME CIENTÍFICO SOBRE
PLATA COLOIDAL
SANTÉ NATURELS®
INTRODUCCIÓN
El uso de la plata en la práctica clínica y en el tratamiento de infecciones se remonta a la antigüedad. A principios del siglo XX, los cirujanos usaban habitualmente puntos de sutura plateados para reducir el riesgo de infección; en los mismos años se utilizaron gotas para los ojos que contenían trazas de plata para tratar las partes que entraron en contacto con patógenos, que infectaron tanto los órganos internos como la piel. Las heridas infectadas fueron tratadas con soluciones de plata, considerando también la eficacia, aunque empíricamente observada, de la regeneración tisular. Este uso continuó más o menos indiscutido hasta alrededor de 1940, cuando se desarrollaron los antibióticos modernos, por lo que el uso de la plata como agente antimicrobiano disminuyó drásticamente (Chopra I. et al., 2007).
Recientemente, sin embargo, la propagación de la resistencia a los antibióticos junto con los efectos tóxicos de los mismos (Morgun A. et al., 2015) ha reavivado el interés por el uso de este metal. Por otro lado, una de las reservas sobre el uso de la plata se debe a que, al ser esta última un metal, podría provocar intoxicaciones en el organismo. El uso excesivo de plata podría conducir a efectos tóxicos como, por ejemplo, el desarrollo de una patología llamada Argyria, que consiste en una coloración azul grisácea de la piel, las mucosas y los ojos causada por el depósito de sales de plata en los tejidos (Becker RO, 1999). Se reconoce que la causa más frecuente de Argyria o Argyrosis es la exposición prolongada a altas dosis de plata, generalmente ingerida o inhalada, en diversas formas. Sin embargo, Argyria es predominantemente una consecuencia de la profesión ejercida en contacto directo con el metal y no está relacionada con el uso esporádico de la plata (Lansdown A.B. et al., 2007). Por lo tanto, es necesario especificar que se trata de situaciones en las que la dosis diaria posiblemente recomendada se ha superado cientos o miles de veces.
En respuesta a la posible toxicidad encontrada con el uso de plata iónica, en los últimos años se ha generalizado el uso de plata coloidal que consiste en nanopartículas de plata en solución acuosa, que parece tener menos efectos tóxicos y una eficacia antibacteriana sin cambios.
Sin embargo, los estudios sobre su eficacia y toxicidad aún no están del todo aclarados.
Por lo tanto, el objetivo de nuestro análisis fue evaluar los efectos de una preparación de plata coloidal distribuida por la empresa Santé Naturels® en células procariotas y eucariotas mediante ensayos in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
Plata usada
La plata utilizada proviene de la empresa Santé Naturels SNC (Via Isonzo 32, Civitanova Marche, Italia) que se ocupa de productos naturales para la salud y el bienestar, especializándose en la producción y distribución de productos coloidales. La plata coloidal se recibió ya en solución y se utilizó como se indica en los diversos experimentos. La plata iónica utilizada como control está en forma de AgNO3 disuelto en agua bidestilada a una concentración de 20 μg/ml.
Cepas bacterianas y fúngicas utilizadas
Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio son las siguientes:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella sonnei (ATCC25931), Escherichia coli (DH5a), Pseudomonas aeruginosa (PO1). La cepa fúngica es Candida albicans (ATCC 10231).
Células humanas utilizadas
HeLa (línea de adenocarcinoma cervical); HDF (fibroblastos dérmicos humanos).
Ensayo de actividad antibacteriana en placa
Se mezclaron alícuotas de 100 µl de las diferentes cepas bacterianas de crecimiento exponencial con 10 ml de medio de cultivo LB y agar blando (0,7%). Se hicieron puntos de 10 µl (200 ng) y 20 µl (400 ng) de plata coloidal o plata iónica o ampicilina (25 ng) sobre las placas. Las placas se incubaron ON a 37°C.
Ensayo de actividad antibacteriana en líquido.
Se realizaron dos tipos de ensayos líquidos.
A) las cepas bacterianas indicadas se cultivaron hasta la fase estacionaria, luego se diluyeron y se cultivaron en presencia de diferentes concentraciones de plata coloidal (2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 10 µg/ml) y plata iónico como control (4 µg/ml, 6 µg/ml) durante 16 horas. Para evaluar el crecimiento bacteriano, se midieron las densidades ópticas a 600 nm usando un espectrofotómetro.
B) las cepas indicadas se cultivaron hasta la fase estacionaria, luego se diluyeron y se cultivaron durante dos horas en presencia de dos concentraciones diferentes de plata coloidal (2 µg/ml, 0,5 µg/ml). Al final de las dos horas, las células se sembraron en placas a diferentes diluciones para calcular el número de células viables capaces de formar colonias (CFU) después del tratamiento.
Ensayo de toxicidad en células humanas
Los ensayos de MTT se realizaron en células humanas cultivadas. El ensayo MTT, cuyo acrónimo indica el compuesto bromuro de di-3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, permite una evaluación colorimétrica de la actividad del metabolismo mitocondrial de las células tratadas. En particular, la succinato deshidrogenasa reduce el MTT a formazán, desarrollando un color que se convierte en un índice de actividad mitocondrial y, por lo tanto, de vitalidad celular.
Las células se sembraron en placas y al día siguiente se reemplazó el medio de cultivo con medio nuevo que contenía plata coloidal o plata iónica a diferentes concentraciones. Después de 24 horas, se aspiró el medio que contenía la plata y las células se trataron con la solución de MTT durante 3 horas. El resultado del experimento se detectó leyendo el espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.
RESULTADOS
Ensayos de actividad antibacteriana en placa
Con el fin de evaluar la actividad antibacteriana de la plata coloidal frente a diferentes cepas tanto Gram + (Staphylococcus aureus, Lysteria monocytogenes) como Gram - (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnei) actividad antibacteriana en placa (ver Materiales y Métodos) . Como se puede observar en la figura 1, la presencia de plata coloidal, así como de plata iónica, tanto en cantidades de 200 ng como de 400 ng provoca la inhibición del crecimiento bacteriano de las distintas cepas analizadas, entre ellas Lysteria monocytogenes para la que existe una menor sensibilidad a la plata iónica y coloidal.
Ensayos de actividad antibacteriana en líquido
Con el fin de evaluar con mayor precisión la acción de la plata sobre las distintas cepas, hemos establecido dos tipos de ensayos de actividad en líquido (ver Materiales y Métodos).
A) en un primer tipo de ensayo evaluamos la actividad de la plata coloidal a varias concentraciones (2,4,8,10 µg/ml) durante 16 horas de incubación ON a 37°C.
Como puede verse en la Figura 2, la plata coloidal ejerce un efecto dependiente de la dosis en todas las cepas analizadas con un efecto de inhibición del crecimiento de aproximadamente el 40 % a una concentración de plata coloidal de 2 µg/ml y del 80-85 % a la concentración de plata coloidal de 10 µg/ml. También en este tipo de prueba se confirma la insensibilidad de Lysteria monocytogenes a la acción de la plata.
B) realizamos un análisis más profundo para evaluar si el efecto que ejercía la plata era inhibición del crecimiento (efecto citostático) o inducción de muerte celular (efecto citotóxico). Elegimos realizar el análisis en una bacteria Gram- representativa (Escherichia coli) y una bacteria Gram+ representativa (Staphylococcus aureus) e introdujimos un microorganismo eucariota (Candida albicans) en el análisis. Los crecimientos se realizaron durante solo dos horas (ver Materiales y Métodos) en presencia de cantidades mucho más bajas de plata coloidal (0,5 μg/ml y 2 μg/ml) y la evaluación del efecto se realizó mediante placas y conteo vital. Como se puede observar en la Figura 3, la aplicación de plata coloidal ejerce un efecto citotóxico significativo tanto a la concentración de 2 μg/ml (75-90 % de mortalidad) como a la aún menor concentración de 0,5 μg/ml (50-70 % mortalidad) tanto en Escherichia coli como en Candida albicans. Por el contrario, el efecto es prácticamente inexistente sobre Staphylococcus aureus, lo que indica un efecto menos marcado de la plata sobre las bacterias Gram+ (ver también la Figura 2 y los datos no mostrados).
En conjunto, estos análisis sugieren que la plata coloidal ejerce un efecto antibacteriano/antifúngico moderado en las condiciones que observamos, con un efecto predominante sobre las bacterias Gram. Nuestros datos también parecen sugerir que el efecto es sobre todo citotóxico ya que observamos una mortalidad considerable a las dos horas del tratamiento con bajas concentraciones de plata (0,5 y 2 μg/ml).
Figura 1. Ensayo de actividad antibacteriana en placas: La figura muestra los puntos de inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de Plata Coloidal (AgC) 200 ng y 400 ng (derecha de las placas) y, como control, en presencia de ampicilina (amp ) y Silver Ionic (AgI) 200 ng y 400 ng (izquierda de las placas).
Figura 2. Ensayo de actividad antibacteriana en líquido: (A) La figura muestra el porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano realizado durante 16 horas a 37 °C en presencia de diferentes concentraciones de plata coloidal (barras azules) y plata iónica (barras azules). gris). El método utilizado fue el de lectura espectrofotométrica.
Figura 3. Ensayo de actividad en líquido: (B) La figura muestra el porcentaje de inhibición del crecimiento realizado durante 2 horas a 37 °C en presencia de dos concentraciones diferentes de plata coloidal. El método utilizado fue el del conteo vital.
Ensayos de toxicidad en células humanas
Evaluamos la posible toxicidad de la plata coloidal en diferentes tipos de células humanas en cultivo (ver Materiales y Métodos).
Para ello decidimos utilizar el ensayo MTT, una prueba de viabilidad celular, que nos permite cuantificar la actividad de una enzima mitocondrial que solo funciona en células vivas. Por tanto, en células con un metabolismo bajo, por tanto con viabilidad limitada, el MTT se reduce muy poco; en contraste, las células que se dividen rápidamente muestran altas tasas de reducción de MTT.
Como se puede observar en la figura 4, el tratamiento con plata coloidal a una concentración de 2 μg/ml no provoca efectos tóxicos tanto en las células de cáncer de cuello uterino (HeLa) como en los queratinocitos inmortalizados (HaCat) y los fibroblastos dérmicos normales (HDF). A concentraciones más altas (4 μg/ml) se produce un ligero efecto tóxico con reducción de la viabilidad celular. Es importante señalar que la plata iónica utilizada como control positivo, por el contrario, ejerce un importante efecto tóxico, provocando una drástica disminución de la vitalidad celular. También se realizaron los mismos experimentos en células Caco-2 (adenocarcinoma de colon) proporcionando resultados similares (datos no mostrados).
Figura 4. Ensayo de viabilidad celular en células eucariotas: La figura muestra la viabilidad celular de células humanas (queratinocitos inmortalizados, células de cáncer de cuello uterino, fibroblastos dérmicos normales) tratadas con dos concentraciones diferentes (2 µg/ml; 4 µg/ml) de plata iónica (barras grises) o plata coloidal (2 µg/ml; 4 µg/ml) (barras azules).
REFERENCIAS
- Chopra I. “El creciente uso de productos a base de plata como agentes antimicrobianos: ¿un desarrollo útil o un motivo de preocupación?” Revista de quimioterapia antimicrobiana (2007) 59, 587–590 doi: 10.1093/jac/dkm006
- Landsdown AB, Williams A., "Resistencia bacteriana a la plata en el cuidado de heridas y dispositivos médicos". J Wound Care (2007) Ene;16(1):15-9.
- Morgun A, Dzutsev A, Dong X, Greer RL, Sexton DJ, Ravel J, Schuster M, Hsiao W, Matzinger P, Shulzhenko N. "Descubriendo los efectos de los antibióticos en el huésped y la microbiota usando redes de genes transkingdom". Intestino. 2015 noviembre; 64 (11): 1732-43. doi: 10.1136/gutjnl-2014-308820. Epub 2015 22 de enero.
Nápoles, 18 de abril de 2016
Prof. Alessandra Pollice
Prof. Ezio Ricca Director del Departamento de Biología
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